Главная страница  |  Описание сайта  |  Контакты
Патент на изобретение №2469321

(19)

RU

(11)

2469321

(13)

C1

(51) МПК G01N33/48 (2006.01)

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ Статус: по данным на 07.12.2012 - нет данных Пошлина:

(21), (22) Заявка: 2011144790/15, 03.11.2011

(24) Дата начала отсчета срока действия патента:

03.11.2011

Приоритет(ы):

(22) Дата подачи заявки: 03.11.2011

(45) Опубликовано: 10.12.2012

(56) Список документов, цитированных в отчете о

поиске: CZIFRA G et al. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703. DOMERUTH, C.H. et al. Hemorrhagic enteritis of turkeys. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. 3rd ed. H.G. Purchase et al. eds. Kendall/Hunt Publishing Co. Dubuque, IA. pp.82-84. 1989. RU 2409385 C2, 20.01.2011.

Адрес для переписки:

630501, Новосибирская обл., Новосибирский р-н, пос. Краснообск ГНУ ИЭВСиДВ, а/я 8, ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии

(72) Автор(ы):

Юшков Юрий Георгиевич (RU),

Афонюшкин Василий Николаевич (RU),

Леонов Сергей Владимирович (RU),

Итэсь Юрий Викторович (RU),

Филиппенко Максим Леонидович (RU),

Дударева Екатерина Викторовна (RU)

(73) Патентообладатель(и):

Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока Россельхозакадемии (ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии) (RU)

(54) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСУ ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ЭНТЕРИТА ИНДЕЕК

(57) Реферат:

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и эпизоотологии. Способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек заключается в исследовании биоматериала от птицы, в реакции непрямой гемагглютинации, где в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кролика с осажденным на них антигеном вируса геморрагического энтерита индеек, а для регулировки скорости оседания эритроцитов используют гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм. 2 табл., 2 пр.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, эпизоотологии, а именно к способам выявления специфических антител [AT] к вирусу геморрагического энтерита индеек [ГЭИ].

Известен способ выявления специфических AT к ГЭИ в сыворотке крови птицы с использованием реакции иммуноферментного анализа [ИФА] (Domeruth, C.H., W.B. Gross and F.W.Pierson. Hemorrhagic enteritis of turkeys. A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens. 3rd ed. H.G. Purchase et al. eds. Kendall/Hunt Publishing Co. Dubuque, IA. pp.82-84. 1989), который является аналогом предлагаемого способа. Однако данный тест не позволяет проводить обнаружение AT к ГЭИ без использования коммерческих тест-систем, связанных с видовой принадлежностью исследуемых образцов, а также требует использования технически сложного и дорогостоящего оборудования для регистрации результатов реакции.

Наиболее близким в техническом отношении и принятым за прототип является способ обнаружения AT к вирусу Ньюкаслской болезни птиц в сыворотке крови птицы с использованием реакции задержки гемагглютинации [РЗГА]. (Czifra G, M Nilsson, D.J.Alexander, R.Manvell, S.Kecskemeti, B.E.Engstrom. Detection of PMV-1 specific antibodies with a monoclonal antibody blocking enzyme-linked immunosorbent assay. Avian Pathol. 1996 Dec; 25(4): 691-703). Однако данный тест не позволяет выявлять AT к вирусу ГЭИ.

Задачей заявляемого решения является расширение арсенала диагностических методов для выявления специфических антител к вирусу ГЭИ. Поставленная задача решается тем, что предложен способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек в сыворотке крови или плазме крови птицы с использованием реакции непрямой гемагглютинации [РНГА], отличающийся тем, что при приготовлении эритроцитарного диагностикума для РНГА необходимо использовать эритроциты кролика, с осажденным на них антигеном вируса ГЭИ, а при постановке реакции - указанный эритроцитарный диагностикум, 96-луночные микропланшеты с V-образным дном и гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм.

Способ осуществляют следующим образом.

Материалы и оборудование: вакцина против геморрагического энтерита индеек «Dindoral», фосфатно-солевой буфер [PBS] рН 7,2-7,4, 1М водный раствор аланина, забуференный 10% раствор формалина, центрифуга, шейкер.

Протокол получения диагностикума.

1. Отмыть эритроциты из 2 мл крови кролика PBS в соотношении 1:5 двукратно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.

2. Ресуспендировать полученную эритроцитарную массу PBS до 12 мл.

3. Добавить к 12 мл суспензии 1,2 мл 10% формалина.

4. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 2 часа.

5. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.

6. Ресуспендировать осадок PBS, доведя до объема 6 мл.

7. Добавить 100 мкл предварительно разведенной, в соответствии с инструкцией и осветленной центрифугированием при 10000 об/мин 2 минуты, вакцины против геморрагического энтерита «Dindoral».

8. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 1 час.

9. Добавить 600 мкл 1М раствора аланина.

10. Инкубировать при 22-24°С, плавно перемешивая на шейкере 10 мин.

11. Осадить центрифугированием при 2000 об/мин в течение 1 минуты.

12. Отмыть осадок PBS в соотношении 1:5 однократно, центрифугируя суспензию при 2000 об/мин 1 минуту.

13. Ресуспендировать осадок PBS, доведя объем до 40 мл.

Полученной суспензии эритроцитов достаточно для проведения исследования 400 проб. Срок хранения диагностикума при +4°С - 1 месяц.

Образцы для исследования: пробы сыворотки крови, плазмы крови.

РНГА проводят по следующему протоколу:

1. Подготовить гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм (коммерческий препарат - Sefadex G25): ресуспендировать их в PBS 1:2; инкубировать для набухания при 22-24°С 2 часа. Использовать осадок гранул.

2. Приготовить серийные двукратные разведения исследуемых сывороток начиная с разведения 1:4 в микропланшетах с V-образным дном в объеме 100 мкл в PBS.

3. Внести в лунки 96-луночного микропланшета с V-образным дном по 50 мкл приготовленных по п.1 гранул Sefadex G25.

4. Внести в лунки микропланшета по 100 мкл эритроцитарного диагностикума.

5. Инкубировать при температуре 22-24°С до формирования зонтиков 2-5 часов, можно на ночь.

В случае положительной реакции в толще гранул сефадекса формируется зонтик, в случае отрицательной реакции эритроциты с иммобилизированным на них вирусным антигеном беспрепятственно просачиваются между гранулами и оседают на дне V-образных лунок в виде пуговки.

Для иллюстрации способа приведены примеры.

Пример 1

Результаты РНГА с сывороткой крови индейки разных возрастов. Отражена динамика прироста титров антител к вирусу ГЭИ у птицы с птицефабрики, неблагополучной по геморрагическому энтериту индеек.

Таблица 1

возраст

Всего проб

отр.

1:2

1:4

1:8

1:16

1:32

1:64

1:128

1:256

1 дн.

12

8

2

2

6 дн.

12

2

4

4

1

1

10 дн.

12

4

6

2

13 дн.

12

6

4

2

18 дн.

12

2

2

2

2

4

19 дн.

12

2

2

4

2

2

25 дн.

12

2

2

6

2

57 дн.

12

12

122 дн.

12

12

Примечание: вакцинация живой вакциной против геморрагического энтерита индеек проводилась в возрасте 22 дней.

Как следует из таблицы, уровень антител к дате вакцинации (22 дня) не снижается за счет естественного распада трансовариальных антител, а растет. Таким образом, одной из ведущих проблем на стационарно неблагополучных по ГЭИ птицефабриках является наличие антител до вакцинации, что способно снизить эффективность вакцинации.

Пример 2

Титры антител в РНГА к вирусу ГЭИ на пике заболевания у реконвалесцентов.

Таблица 2

Титры антител к вирусу ГЭИ

Возраст 19 дн. на пике падежа, кол-во проб

Возраст 36 дн. на спаде падежа, кол-во проб

0

9

1:2

1:4

1:8

1

1

1:16

1:32

9

% реагирующих (за положительные принимаем 1:8 и выше)

10%

100%

Как следует из таблицы 2, защитными титрами антител в РНГА в очаге заболевания можно считать значение 1:32.

Формула изобретения

Способ выявления специфических антител к вирусу геморрагического энтерита индеек, включающий исследование биоматериала от птицы, отличающийся тем, что используют реакцию непрямой гемагглютинации, где в качестве эритроцитарного диагностикума используют эритроциты кролика с осажденным на них антигеном вируса геморрагического энтерита индеек, а для регулировки скорости оседания эритроцитов используют гранулы декстрана размерами от 200 до 500 мкм.